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植物酶活案例

浏览:56 发表时间:2020-10-19 15:58:37

1 . 超氧化物歧化酶SOD测定

1.1实验方法简介

采用试剂盒测定超氧化物歧化酶SOD

1.1.1测定原理

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-),O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜,后者在560nm处有吸收;SOD可清除O2-,从而抑制了甲臜的形成;反应液蓝色越深,说明SOD活性愈低,反之活性越高。

1.1.2试剂

1)提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;

2)试剂一:液体15mL×1瓶,4℃保存;

3)试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存,用时加入27mL蒸馏水,充分摇匀;

4)试剂三:液体175µL×1支,4℃保存;(与蒸馏水1:1稀释后再用)

5)试剂四:液体10mL×1瓶,4℃保存。

1.1.3实验步骤

1)粗酶液提取

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆,8000g  4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2)测定步骤

I 分光光度计预热30min以上,调节波长至560nm,蒸馏水调零。

II 测定前将试剂一、二和四 室温放置。

Ш 在EP 管中加入下列试剂:


试剂名称(μL)

测定管

对照管

试剂一

240

240

试剂二

510

510

试剂三

6

6

样本

90

/

试剂四

180

180

蒸馏水

/

90

充分混匀,室温静置30min后,560nm 处测定各管的吸光值A。

注意事项:

试剂三为酶,不可冷冻,使用时在冰上放置。

对照管只需要做一管。

1.1.4结果计算

1)抑制百分率的计算

抑制百分率=(A对照管-A测定管)÷A对照管×100%

尽量使样本的抑制百分率控制在30-70%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%,则通常需要调整加样后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需要将样本用提取液适当稀释;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需要重新准备浓度比较高的待测样本。

2)SOD酶活性单位:在上述黄嘌呤氧化酶耦连反应体系中抑制百分率为50%时,反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL)。

3)组织SOD活性按样本鲜重计算:

SOD活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总]÷(W×V样÷V样总)×样本稀释倍数

式中:

V反总:反应体系总体积,mL;

V样:加入反应体系中样本体积,mL;

V样总:加入提取液体积,mL;

W:样品质量,g。

 

2 . 过氧化物酶POD测定

2.1实验方法简介

采用试剂盒测定过氧化物酶POD

2.1.1实验原理

POD广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD 催化 H2O2 氧化特定底物,在 470nm有特征光吸收。

2.1.2试剂

1)提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

2)试剂一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

3)试剂二:液体0.33mL×2瓶,4℃保存;用时每瓶加入5mL试剂一;用不完的试剂4℃保存一周;

4)试剂三:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存。

2.1.3实验步骤

1)粗酶液提取

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2)测定步骤和加样表


试剂名称(µL

测定孔

样本

15

蒸馏水

270

试剂一

520

试剂二

130

试剂三

135

测定前将试剂一、二和三25℃放置10min。在1mL玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂,立即混匀并计时,记录470nm下30s时的吸光值A1和1min 30s后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。

2.1.4结果计算

按样本鲜重计算:

单位定义:每g组织在每mL反应体系中每分钟使A470变化0.005定义为一个酶活力单位。

POD(U/g鲜重)=△A×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.005÷T×A

式中:

V反总:反应体系总体积,mL;

V样:加入样本体积,mL;

V样总:加入提取液体积,mL;

T:反应时间,min;

A:稀释倍数;

W:样品质量,g。

 

3.1 丙二醛含量测定

3.1.1实验原理

MDA与硫代巴比妥酸缩合,生成红色产物,在532nm有最大吸收峰,进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量;同时测定600nm下吸光度,利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。

3.1.2试剂

1)提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;

2)试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存。

3.1.3实验步骤

1)粗酶液提取

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10的比例进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2)测定步骤

吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中,再加入0.2mL样本,混匀。

95℃水浴保温30min,取出置冰水浴冷却,然后10000g,离心10min,

吸取上清液于1mL比色皿中,测定532nm和600nm处的吸光度,蒸馏水调零,测各管吸光度值。△Abs=A532-A600

3.1.4结果计算

组织中MDA含量(nmol/g鲜重)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)

式中:

V反总:反应体系总体积,L;

ε:丙二醛摩尔消光系数,155×103 L/mol/cm;

d:比色皿光径,1cm;

V样:加入样本体积,mL;

V样总:加入提取液体积,mL;

W:样本质量,g

 

4.1过氧化氢酶(CAT)测定

4.1.1测定原理

过氧化氢酶(CAT)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最重要的H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。

H2O2在240nm下有特征吸收峰,CAT能够分解H2O2,使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间下降,根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

4.1.2试剂

1)提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

2)试剂一:液体60mL×1 瓶,4℃保存;

3)试剂二:液体100μL×3瓶,4℃保存,

4.1.3实验步骤

1)粗酶液提取

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10的比例进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2)测定步骤

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至240nm处,蒸馏水调零。

2、CAT检测工作液的配置:用时在每瓶试剂二(100μL)中加入20mL试剂一,充分混匀,作为工作液;用不完的试剂4℃保存一周。

3、测定前将CAT检测工作液25℃水浴10min。

4、取1mLCAT检测工作液于1mL石英比色皿中,再加入35μL样本,混匀5s;室温下立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算△Abs=A1-A2

4.1.4结果计算

    单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

组织中CAT含量(U/g鲜重)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T

式中:

V反总:反应体系总体积,L;

ε:H2O2摩尔消光系数,4.36×104 L/mol/cm;

d:比色皿光径,1cm;

V样:加入样本体积,mL;

V样总:加入提取液体积,mL;

W:样本质量,g

T:反应时间,1min


 


SOD酶活力

POD酶活力

MDA酶活力

CAT酶活力

样品名称

(U/g鲜重)

(U/g鲜重)

(nmol/g)

(U/g)

154

189.505

191076.815

16.913

150.562

157

150.008

149800.000

9.108

146.288

160

242.990

102834.016

12.163

145.934

161

185.456

134936.285

10.473

187.663

162

274.655

137605.484

10.614

188.304

163

122.440

88950.067

11.144

146.449

165

184.585

145627.220

8.684

174.982

166

321.184

196175.253

8.946

228.585

 


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