植物激素检测

技术路线

检测方法

外标法

▶   外标法：通过对照品浓度、峰高/面积和待测物的峰高/面积，计算待测物浓度。

▶   用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。

同位素内标法

▶   内标法：通过内标物与对照品的浓度、峰高/面积计算校正因子，然后通过校正因子、待测物峰高/面积、内标物浓度、峰高/面积，计算待测物浓度；需要与待测物性质非常相似（如吸收系数、出峰位置，但是不能干扰待测物)的内标物。

▶   是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。

内标法的优势

▶   内标相当于一根标杆，利用化合物和内标的峰面积比值来定量，减小或消除了基质效应，定量更准确。

▶   操作过程中样品和内标是混合在一起注入色谱柱，因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响影响定量结果。

▶   内标法抵消了前处理的操作误差，乃至流动相、检测器的影响。

检测仪器

我司有多台液质联用仪器如安捷伦1290高效液相色谱仪串联AB公司Qtrap6500质谱仪、LC40串联AB Qtrap6500+ 2台、安捷伦1260串联AB Qtrap 5500 3台，安捷伦1260高效液相色谱仪串联6420A 2台等，可根据不同检测目地及需求选择最适合的仪器，满足不同客户的需求。

其中QTRAP 6500质谱仪采用新型加热方式，可在30秒内升温至750℃，可以针对不同的化合物设置不同的分析温度。在具备三重四级杆扫描的同时，还具备线性离子阱的同时定性和定量的多种扫描方式。在同一个样品分析多个化合物的情况下各离子之间不会相互干扰，稳定性和准确性都极高。

我们的优势

三重四级杆——线性离子阱复合质谱系统，最灵敏的定量系统，可以快速准确的，对复杂基质中的多种待测物定量。具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快等特点。

选用特定色谱柱，此柱子只用来分析植物激素，不用来分析其他指标的样品，固定的流动相不会对柱子造成伤害提高稳定性。另外我们会每年更换一根色谱柱，以保证分离、分析效果。

使用仪器前会做相应的检查，各项指标无异常才会使用。样品上机前会先跑标准品，标准品数据没有问题才会上样。

质控说明

▶   进样前会先跑标准品，每个点进两针，保证重复性没有问题后才会跑样品。

▶   上样时每十个样进一个质控样（标样），一般进中间浓度的质控样，与原来的峰面积进行比较，如果峰面积偏差不超过10%则判断稳定性合格。

▶   客户有要求的话可对其样品做添加回收，但一般样品都是盲样，无法很好的控制添加回收的标样量（一般要求添加标样的量和样品中的目标物含量一致）。建议用内标法做会更准确。

▶   对于内源植物激素很难做基质空白对照，如做植物生长调节剂等外源激素，客户可提供空白基质，实验时可扣除基质干扰，使结果更准确。

取样方法

1、样品类型

▶   细胞，取样后离心，去除培养基，立即放入液氮中，之后-80°保存。

▶   叶片、茎、花等，取下后立即放入液氮中，之后-80°保存。

▶   果实的果肉、果皮等，如果野外现场不具备分离条件，需尽快(30MIN内)转移至室内，分离样品放入液氢中，之后-80°保存。

2、混合取样

▶   每份样品混合来自至少3株以上的组织。以水稻叶片为例：取同一时期，表型基本一致的，同一个部位的1片叶片，同时取6株，放到的10M离心管中，并迅速放入液氮中。

3、样品重量和重复

▶   新鲜的、干净的植物样品(鲜样)，样本建议量>1G，最少量>0.6G。准备3份及以上生物学重复。

4、储存和运输

▶   采摘样品后立即用液氨速冻统一使用5ML或15ML质量较好的离心管(根据样本类型、大小选择离心管规格)装入样品，需足量的干冰运输至公司。所有盛装样品的管子需在常温下用记号笔清晰标注样品名称(勿在冷冻温度下标注)。另外，由于植物对损伤的应激反应会影响植物激素含量，为得到准确并符合预期的结果，尽量减少植物样品在常温下的暴露时间。

案例分析

NAC26介导的JA合成参与葡萄抗旱机制研究

研究者从抗旱种质资源山葡萄中克隆了NAC家族基因VaNAC26,并对VaNAC26在非生物胁迫中的功能以及可能的调控机制进行研究。

研究发现,该基因可提高植株在干旱胁迫下活性氧清除能力。拟南芥microarray芯片分析发现,茉莉酸(JA)合成关键基因以及JA信号通路相关基因均有显著上调,而过表达VaNAC26的拟南芥在正常状态下叶片JA含量均显著髙于野生型,说明该基因可能通过提高JA合成途径调控植物耐旱性。在干早条件下山葡萄叶片中JA含量同样显著上升,说明山葡萄的内源JA同样参与了其干旱胁迫应答（见下图）。

参考文献：Linchuan Fang,.et al. Expression of Vitis amurensis NAC26 in Arabidopsis enhances drought tolerance by modulating jasmonic acid synthesis. Journal of Experimental Botany, 2016, 9, 2829-2845.