项目文章 | 新疆农业大学研究揭示了MsPYR1-like在苹果属植物种子休眠和萌发中的潜在作用

新疆野苹果（Malus sieversii）是天山山脉野生果林的建立物种，同时也是国际生物多样性保护的重点物种。由于其上保留了苹果的原始基因，是未来苹果遗传改良和人工选育栽培品种改善的后备基因库。种子的萌发和休眠作为植物生长繁衍的重要机制，深入理解脱落酸（ABA）受体在苹果属植物种子休眠和萌发中的作用对为培育具有特定休眠特性的苹果品种提供理论基础。

近日，新疆农业大学，叶春秀副教授在期刊Molecular Biotechnology杂志上发表了题为Construction of a Membrane Yeast Two‑Hybrid Library and Screening of  MsPYR1‑Like Interacting Proteins in Malus sieversii的研究论文，揭示了MsPYR1-like在苹果属植物种子休眠和萌发中的潜在作用。

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研究内容

为探究ABA受体MsPYR1-like在新疆野苹果种子中的生物学效应，特别是其在种子休眠和萌发过程中的作用。

从野生苹果（Malus sieversii）种子中克隆了与ABA（脱落酸）受体相关的pyrabactin resistance 1-like (PYR1-like) 基因。并对其编码的206个氨基酸的蛋白质进行了生物信息学分析，发现其具有PYR/PYL/RCAR家族的典型结构域。生物信息学分析表明，MsPYR1-like与苹果和其他植物中的PYR1-like蛋白显示出高度的序列相似性，表明这一家族在不同物种中高度保守。

图1 苹果MsPYR1样基因的生物信息学分析。MsPYR1样氨基酸序列的多重比对

通过对MsPYR1-like蛋白的理化性质进行了分析，并通过生物信息学工具预测了其二级和三级结构。MsPYR1-like蛋白的保守结构域包含一个疏水配体结合位点，这是PYR/PYL/RCAR蛋白家族的特征。该蛋白具有33个潜在的磷酸化位点，包括14个丝氨酸、15个苏氨酸和4个酪氨酸位点。MsPYR1-like蛋白的二级结构主要由α螺旋（37.38%）、延伸链（15.05%）、β转角（6.80%）和无规则卷曲（40.78%）组成，其中无规则卷曲占主导，与三级结构中同样观测到的许多无规则卷曲共同表明了其结构可能具有不稳定性。通过与番茄PYL1蛋白的三级结构进行比对，发现MsPYR1-like蛋白与SlPYL1有76.04%的序列一致性，GMQE得分为0.84，表明两者可能具有相似的生物学功能。

图 2 MsPYR1-like的基因序列分析以及预测蛋白的保守结构域、二级三级结构和磷酸化位点

将MsPYR1-like基因克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的表达载体中，通过农杆菌介导的瞬时转化在烟草叶片中观察其亚细胞定位。观察到MsPYR1-like蛋白在细胞核和细胞膜中，这与之前报道的AtPYR1等蛋白的亚细胞定位不同，表明MsPYR1-like可能具有独特的功能。

图 3 通过农杆菌介导的瞬时转化在烟草叶片中观察MsPYR1-like蛋白的亚细胞定位

利用长距离PCR（LD-PCR）技术将第一链cDNA扩增成三框双链cDNA，然后进行均质化处理和片段筛选。将双链cDNA与pPR3-N载体进行同源重组反应，构建酵母膜系统双杂交文库，并评估文库的容量、插入片段的平均长度和重组率。确保了文库的质量和适用性，为后续的酵母双杂交筛选实验奠定了基础。

图 4 MsPYR1-like酵母膜系统双杂交文库构建

使用含有MsPYR1-like基因的诱饵载体pBT3-SUC-PYR1与文库载体共转化酵母菌株，从文库中筛选出28个与MsPYR1-like相互作用的候选蛋白，这些相互作用蛋白是ABA信号传导的功能成分，如PP2C等，揭示了MsPYR1-like在ABA信号通路中的复杂调控机制。通过与不同植物中PYL/PYR/RCAR家族基因的功能比较，如草莓FaPYR1、拟南芥PYL11/RCAR5等，揭示了MsPYR1-like基因的共性和特性。这些为理解MsPYR1-like在新疆野苹果中的独特作用提供了重要参考。

图 5 使用pPR3-N膜酵母双杂交（MYTH）文库筛选与MsPYR1-like相互作用的蛋白质

将MsPYR1-like基因克隆到过表达载体中，通过农杆菌介导的转化方法在拟南芥中进行过表达，并分析其对种子萌发的影响。观察到种子萌发受到抑制，表明MsPYR1-like可能在调控种子萌发中起负向调控作用。这进一步支持了MsPYR1-like在调控种子休眠和萌发中的作用。

图 6 与新疆野苹果转录组中表达的MsPYR1-like互作基因，以及MsPYR1-like在拟南芥中过表达的表型指标分析

分析MsPYR1-like相互作用基因的GO功能富集结果，发现这些基因与核糖体的结构和功能、细胞质小核糖体亚基、蛋白质-核酸复合物的组成有关，并参与细胞质翻译和核糖核蛋白复合物的生物合成。这些基因还响应脱落酸，参与种子成熟、萌发的负向调控和幼苗发育。KEGG通路分析显示，这些基因参与翻译、遗传信息处理、核糖体功能和氧化磷酸化等过程，以及分子伴侣和蛋白质折叠、分类和降解的相关途径。利用STRING数据库和Cytoscape软件预测MsPYR1-like蛋白与其他蛋白的相互作用网络。揭示了其在ABA信号传导途径中的潜在作用。

图表 7 KEGG通路分析MsPYR1-like的互作基因

图 8 MsPYR1-like蛋白与其他蛋白的蛋白质-蛋白质互作网络

研究结果

综上所述，该文章为理解MsPYR1-like在苹果属植物种子休眠和萌发中的作用提供了新的见解，并为进一步研究ABA信号传导途径提供了基础。这些发现有助于揭示种子休眠解除的分子机制，对于培育具有特定休眠特性的苹果品种具有潜在的应用价值。

原文链接：

https://doi.org/10.1007/s12033-024-01199-2