文章标题：Single-cell resolution analysis reveals the preparation for reprogramming the fate of stem cell niche in cotton lateral meristem

发表期刊：Genome Biology

影响因子：17.902

作者单位：华中农业大学

DOI: 10.1186/s13059-023-03032-6

2023年8月25日，华中农大张献龙教授领衔的棉花团队在Genome Biology杂志上发表了题为“Single-cell resolution analysis reveals the preparation for reprogramming the fate of the plant stem cell niche in lateral meristems”的研究论文。该文用Jin668和不可再生材料TM-1为实验对象，结合单细胞测序技术在单细胞层面解析棉花的体细胞胚胎发生机制，通过对不同再生能力材料的对比，挖掘到决定体细胞胚胎发生能力的关键基因并构建了棉花体细胞胚胎发生的基因调控网络。

研究目的

高等植物的体细胞再生方式主要有器官发生和体细胞胚胎发生，通过农杆菌介导遗传转化并体细胞胚胎发生或器官再生目前是获得转基因植物的主要方式。棉花是典型的通过体细胞胚胎发生途径实现植株再生的作物，是研究体细胞胚胎发生过程的经典模型。

棉花的体细胞培养、植株再生过程非常耗时且是高度基因型依赖的，目前只有少数棉花品种（基因型）能够通过组织培养获得体细胞再生植株。如何提高棉花的体细胞再生效率、打破基因型依赖性是亟待解决的问题。

研究对高再生能力的棉花品种Jin668和低再生能力的TM-1的下胚轴组织进行了高分辨率的单细胞转录组分析，揭示了不同细胞类型和状态之间的异同和转换。

研究内容

下胚轴是农杆菌介导棉花遗传转化的主要外植体材料，农杆菌主要在棉花下胚轴的初生维管组织中表达转基因，然后通过体细胞胚发生产生稳定转化的愈伤组织和再生植株。体细胞经过脱分化形成愈伤组织是体细胞胚胎发生的关键步骤，棉花下胚轴对于激素诱导的响应十分迅速。

图1 GFP和RFP报告基因在棉花下胚轴初生维管组织表达

在培养基上诱导0、1h、6h、12h的Jin668和TM-1下胚轴进行单细胞取样，根据marker基因的表达情况，最终确定下胚轴的7种主要的细胞类型，Jin668和TM-1的细胞类型具有高度的一致性。

图2 下胚轴的7种主要的细胞类型

与生长素、细胞分裂素和伤口诱导相关的基因在初生维管组织细胞类型，包括初生木质部，薄壁组织和形成层细胞中表达，因此推测分化程度较低的细胞类型对激素的诱导更加敏感，是愈伤组织形成的主要细胞类型。

图3 棉花转化受体-下胚轴细胞类型鉴定

为进一步了解细胞命运向胚胎命运转变背后的分子机制，团队对这两个品种的相同细胞类型的基因表达情况进行了分析。研究发现，首先，在初生木质部、形成层和薄壁细胞中鉴定到许多和再生相关的差异基因（DEGs），这些差异基因在Jin668和TM-1中有不同的表达模式——很多体细胞胚胎发生相关的基因在可再生材料Jin668中上调表达，而在TＭ-1中下调表达。其中，维持生长素极性分布的基因以及生长素内流相关基因AUX/LAX在Jin668的形成层和薄壁组织细胞中特异表达，而一些生长素外流的基因在这些细胞类型中下调表达，这表明生长素的分布和极性转运对于细胞的脱分化和再分化有重要作用。

图4 Jin668和TM-1相同细胞类型中的差异表达基因

拟时序分析结果发现，Jin668和TM-1的细胞有不同的生长素分布模式。和TM-1相比，Jin668初生木质部细胞有明显的生长素极性建立，更容易脱分化形成愈伤组织。同样，RNA速率结果表明，TM-1的初生木质部细胞更倾向于分化为根细胞类型而不是形成愈伤组织。以上结果表明，在棉花下胚轴体细胞胚胎发生过程中，初生维管组织细胞是形成愈伤组织的主要细胞类型，生长素是影响细胞去分化的主要因素，生长素的极性转运决定了细胞获得胚胎的能力。此外，不同细胞类型之间的细胞通讯也影响细胞的去分化。在这个过程中，一些决定性的基因影响愈伤组织的诱导和体细胞胚胎的形成。最后，团队通过敲除和过表达实验验证了生长素转运相关基因LAX2影响愈伤组织诱导并能提高胚性愈伤的形成。

图5 拟时序分析结果表明Jin668和TM-1的细胞有不同的生长素分布模式

进一步探究一些与体细胞再生相关的基因（“再生因子”），通过深入分析这些基因的作用机制，希望通过将这些基因导入到那些难以或者无法再生的棉花品种中，实现高效的体细胞再生。从而可以打破棉花体细胞植株再生只能在某些品种上进行的局限，让更多的棉花品种具备植株再生的能力，为棉花功能基因组学和分子育种奠定坚实的技术基础。

图 6 棉花体细胞胚胎发生分子调控网络

研究意义

这篇文章为揭示植物体细胞再生机制提供了新的视角和方法，也为棉花遗传转化和分子育种提供了新的思路和候选基因。